1、目前全世界約有3.5億慢性HBV(hepatits B virus,HBV)感染者,HBV持續(xù)感染是導致慢性肝炎后肝硬化、肝細胞性肝癌等疾病的重要原因,嚴重威脅著人類健康.目前使用的藥物如干擾素、核苷類似物等在治療的有效性、治療后復發(fā)率等方面尚不理想.RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一項新興的基因沉默技術,是指長21-23bp的雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)誘導序列高

2、度同源的mRNA降解從而導致轉錄后基因沉默的現(xiàn)象.研究表明,長度在21-23bp的siRNA并不激活哺乳動物細胞的非特異性反應,使siRNA用于抗HBv治療成為可能.由于RNAi的作用對象是病毒的mRNA,可針對HBV基因組的不同保守區(qū)域設計一個或多個siRNA,減少病毒通過變異逃避攻擊的可能性,從而彌補核苷類似物類藥物的不足.目前的研究已分別在細胞和動物實驗中證實RNAi的抗HBV的作用,使RNAi有望成為抗乙肝病毒治療的新選擇.而將

3、RNAi用于抗HBV的臨床治療,一個理想的輸送siRNA的載體是其中的關鍵環(huán)節(jié).近些年分子生物學迅速發(fā)展,人們對病毒基因組的結構、功能以及感染機制的研究不斷深入,病毒載體的構建技術不斷得到改進并在基因治療中顯示了良好的應用前景.腺病毒是目前基因治療中應用最廣的病毒載體之一,作為非整合類病毒,具有感染的宿主范圍廣,外源基因表達水平高,在受染細胞內不發(fā)生整合,沒有致癌和致突變的危險等優(yōu)點,在應用RNAi治療疾病的研究中倍受關注.本實驗通過構

4、建同時表達GFP和shRNA的重組腺病毒載體,體外感染具有HBV持續(xù)復制和病毒蛋白表達能力的HepG2.2.15細胞,觀察其對HBV復制的抑制效果,驗證腺病毒載體輸送的shRNA抑制HBV復制的有效性并為進一步的動物實驗打下基礎,研究和評價該重組腺病毒對HBV持續(xù)感染的可能治療作用和應用前景,旨在發(fā)現(xiàn)一種更具備臨床治療可用性的載體. 1、重組穿梭質粒pShuttle+GFP+shDNA的構建 利用BglII和BamHI

5、雙酶切后重新連接獲得不含HindIII酶切位點的質粒pEGFP-C切,設計兩端含HindIII和BglII酶切位點的引物擴增包括CMV啟動子的綠熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達框.PCR產物經雙酶切后與載體質粒pShuttle連接,通過特異性PCR反應、轉染HEK293細胞等方法篩選和鑒定有效克隆,獲得重組質粒pShuttle+GFP.再設計一引物從質粒pAV6擴增含U6啟動子的針對HBV S基

6、因579-597位的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)表達框,經酶切純化后克隆至pShuttle+GFP載體,特異性PCR反應、測序鑒定獲得重組質粒pShuttle+GFP+shDNA. 2、重組腺病毒載體的構建與鑒定 將質粒pShtattle+GFP+shDNA用PmeI酶切純化后,取線性化質粒50-100ng,在200Ω,2.5KV,25μF條件下電轉化至BJ5183感受態(tài)細菌,菌液在卡那

7、抗性的平板培養(yǎng)過夜,次同挑取中、小克隆搖菌,抽提質粒,用PacI酶酶切鑒定陽性克隆后將質粒轉化DH5a感受態(tài)細菌,以獲得產量更多的重組腺病毒質粒. 3、重組腺病毒的包裝、擴增與病毒滴度測定 取5ug用PmeI酶切后的線性質粒用于轉染HEK293細胞,待細胞基本全部出現(xiàn)病變效應后收集細胞.收集到的細胞上清液和細胞裂解液再次感染HEK293細胞,待3-5天細胞全部出現(xiàn)病變效應后收集到更多的病毒液.以不同比例稀釋細胞裂解液,

8、分別感染HEK293細胞,30小時后流式細胞儀檢測表達GFP的細胞數(shù)量,估計病毒滴度. 4、不同MOI重組腺病毒對RNAi效果的影響 在24孔培養(yǎng)板中接種HepG2.2.15細胞,培養(yǎng)24-48h,待細胞達40-50﹪融合率后,分別按MOI為80,160的重組腺病毒量感染細胞.第2,5,8,11天收集細胞上清進行HBsAg和HBeAg的放射免疫法檢測和HBV DNA的熒光定量PCR的檢測;第2天收集細胞進行流式細胞儀GF

9、P表達細胞數(shù)的檢測:第4天收集細胞進行HBV RNA的檢測. 5、HepG2.2.15細胞上清HBsAg和HBeAg的檢測 MOI為80,160的重組腺病毒量感染細胞后,上清檢測顯示HBsAg和HBeAg的分泌作用組均較相應對照組下降,這種下降作用在第8天達到高峰,HBsAg和HBeAg的抑制率分別為64﹪(MOI=80),92﹪(MOI=160)和39﹪(MOI=80),61﹪(MOI=160).抑制作用一直持續(xù)到11

10、天.上述結果表明AD-GFP-ShDNA抑制HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg. 6、HepG2.2.15細胞中HBV RNA的檢測 感染后第4天,收集細胞抽提RNA,逆轉錄后以cDNA為模板,設計HBc基因區(qū)引物擴增目的基因,同時.以β-actin基因作為內參基因進行PCR擴增,各取等量PCR產物電泳,結果顯示作用組目的基因條帶弱于對照組,顯示HBVRNA被腺病毒輸送的shRNA抑制. 7、

11、HepG2.2.15細胞上清HBV DNA的檢測 收集病毒感染2d,5d,8d,11d的細胞培養(yǎng)上清,提取HBV DNA,實時熒光定量PCR檢測HBV DNA拷貝數(shù).對照組AD.GFP組與作用組AD-GFP-shDNA組在感染后HBV DNA拷貝數(shù)均逐漸上升至11天達到高峰,但作用組AD-GFP-shDNA組在感染5天后HBV DNA載量的上升趨勢明顯弱于對照AD-GFP組,兩者的差距在第11天達到最大.結果顯示腺病毒載體輸送的