1、草魚(yú)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，其產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量20％。草魚(yú)出血病是草魚(yú)魚(yú)種階段最為嚴(yán)重的疾病，該病發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，流行范圍廣，死亡率高，其病原為草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）。草魚(yú)呼腸孤病毒已被證實(shí)是致病力最強(qiáng)的水生呼腸孤病毒，到目前為止，已報(bào)道的草魚(yú)呼腸孤分離株有20多株。根據(jù)目前已有研究，草魚(yú)呼腸孤病毒主要有三種基因型，不同基因型的毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性均小于30％，而同一基因型的毒株核

2、苷酸和氨基酸序列的同源性均大于95％。不同分離株在基因組帶型、基因組序列、對(duì)草魚(yú)的致病能力、致細(xì)胞病變能力等方面有一定的差異。草魚(yú)呼腸孤病毒存在不同的基因型也給草魚(yú)出血病的防治帶來(lái)了困難。目前，草魚(yú)出血病的預(yù)防和治療主要依賴疫苗免疫預(yù)防與天然植物藥物治療等方法，但效果有限。分離鑒定草魚(yú)呼腸孤病毒流行毒株，探索新的草魚(yú)出血病預(yù)防與控制技術(shù)具有較大的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。本研究針對(duì)草魚(yú)出血病開(kāi)展了草魚(yú)呼腸孤病毒流行株的分離鑒定和運(yùn)用RNA干擾

3、(RNAinterference，RNAi)技術(shù)抑制草魚(yú)呼腸孤病毒的復(fù)制相關(guān)研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.草魚(yú)呼腸孤病毒流行毒株的分離鑒定:從湖北患典型草魚(yú)出血病的草魚(yú)體內(nèi)分離到一株新致病型草魚(yú)呼腸孤病毒，暫命名為GCRV-104。采用細(xì)胞培養(yǎng)分離的技術(shù)，分離并純化病毒，經(jīng)人工感染試驗(yàn)、電鏡超微觀察、病毒的理化特性分析及病毒的基因組分析，確認(rèn)該分離株屬于草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅲ型。用該病毒進(jìn)行人工感染健康草魚(yú)，可復(fù)制出自然發(fā)病類似癥狀

4、;病毒感染草魚(yú)腎臟細(xì)胞系(CIK)可以產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變。病毒感染細(xì)胞的超薄切片電鏡觀察結(jié)果顯示，病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，呈晶格狀排列，雙層衣殼，無(wú)囊膜，直徑約60-70nm;凍融、氯仿、乙醚、56℃1h處理對(duì)病毒滴度影響不顯著，65℃1h處理病毒滴度下降顯著。病毒基因組SDS-PAGE分析和核酸敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，其基因組由11個(gè)分段的RNA核酸節(jié)段組成，為典型的水生呼腸孤病毒基因組結(jié)構(gòu)。病毒基因組S8節(jié)段全長(zhǎng)基因的克隆測(cè)序分析其全長(zhǎng)核苷

5、酸數(shù)目為1319bp編碼VP6蛋白，與Genbank中登錄的草魚(yú)呼腸孤病毒分離株GCRV-873，GCRV-991，GCRV-875，GCRV-876的氨基酸序列的同源性僅為22.6％。該流行毒株的分離鑒定為研究草魚(yú)出血病的流行病學(xué)、診斷方法與防治技術(shù)提供了重要的病原材料。
　　 2.真核表達(dá)載體介導(dǎo)的siRNA抑制草魚(yú)呼腸孤病毒的復(fù)制:針對(duì)草魚(yú)出血病呼腸孤病毒(GCRV-JX09-01)分節(jié)段基因組L2片段上的RNA聚合酶基因

6、(RdRp)和S10片段上的外衣殼蛋白基因(OCP)，設(shè)計(jì)并合成可轉(zhuǎn)錄為siRNA結(jié)構(gòu)的DNA分子，利用在合成的DNA分子上引入的限制性酶切位點(diǎn)，將合成的DNA分子克隆到pSilencer真核表達(dá)載體中，構(gòu)建含有siRNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄載體pSi-1286，pSi-117，經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序分析確認(rèn)重組載體的正確性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法用重組載體轉(zhuǎn)染草魚(yú)腎臟組織細(xì)胞(CIK)，并用感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01的GCRV感染CIK細(xì)胞，分別通過(guò)細(xì)

7、胞病變效應(yīng)(CPE)、real-time RT-PCR、病毒滴度測(cè)定來(lái)評(píng)定載體轉(zhuǎn)錄siRNA對(duì)GCRV在CIK細(xì)胞中復(fù)制的影響情況。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的siRNA載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA可以(
　　 )有效抑制CIK中GCRV的復(fù)制，病毒滴度下降，干擾組GCRV mRNA的水平僅為病毒陽(yáng)性對(duì)照組的11.22％和26.86％，而陰性對(duì)照組沒(méi)有明顯的抑制效果。該結(jié)果說(shuō)明真核表達(dá)載體介導(dǎo)的siRNA可以作為抑制GCRV感染和復(fù)制的新途徑。

8、
　　 3.siRNA多表達(dá)載體抑制不同基因型GCRV分離株的復(fù)制:為了實(shí)現(xiàn)RNA干擾可以同時(shí)抑制不同基因型草魚(yú)呼腸孤分離株的復(fù)制，本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了同時(shí)靶向流行株GCRV-JX09-01(GCRVⅠ型)及GCRV-104(GCRVⅢ型)的siRNA多表達(dá)載體，pMultisiVP2/2（靶向GCRV-JX09-01和GCRV-104的VP2蛋白基因）;pMultisiVP6/7（靶向GCRV-JX09-01 VP7蛋白基因和G

9、CRV-104 VP6蛋白基因）。兩個(gè)siRNA多表達(dá)載體均可同時(shí)抑制GCRV-JX09-01和GCRV-104在CIK細(xì)胞上的復(fù)制，并且無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)染pMultisiVP2/2組，GCRV-JX09-01、GCRV-104 VP2mRNA拷貝數(shù)分別下降為10.98±2.5％，10.16±3.1％;轉(zhuǎn)染pMultisiVP6/7組GCRV-JX09-01 VP7、GCRV-104 VP6 mRNA拷貝數(shù)分別下降為19.37±3.