1、飼用益生菌可以作為添加劑用以促進畜禽動物健康快速生長，其中枯草芽孢桿菌以其良好的抗逆性及產(chǎn)酶能力，同時能夠消耗游離氧以維持腸道厭氧環(huán)境拮抗腸道有害菌群而被廣泛應(yīng)用。飼用益生菌作為活性微生物，需要嚴(yán)格的安全性評價，目前主要針對其潛在感染性、耐藥性等方面展開研究。就飼用枯草芽孢桿菌而言，除了對其感染性和耐藥性方面進行安全性評價，對于其潛在的產(chǎn)蠟樣芽孢桿菌樣毒素的風(fēng)險也制定了相關(guān)評價方法，但是全面開展飼用枯草芽孢桿菌自身代謝物以及其引起畜禽代

2、謝差異在食品安全性方面的研究依然相對滯后。因此本課題主要通過分離鑒定飼用枯草芽孢桿菌，測定飼喂枯草芽孢桿菌后對仔豬血清生化和免疫指標(biāo)的影響，建立熒光定量 PCR方法考察它對豬腸道主要菌群影響；同時建立LC/MS-IT-TOF方法，對枯草芽孢桿菌開展體外代謝研究以及它對豬消化道和可食性組織中代謝影響的研究，初步獲得益生枯草芽孢桿菌在體外代謝和仔豬體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的差異代謝物信息，為后期對差異代謝物進行定性定量研究和進一步借助微生物代謝物

3、組方法對飼用益生枯草芽孢桿菌代謝物方面開展食品安全性評價的研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.枯草芽孢桿菌J1220分離鑒定及活性測定
　　通過常規(guī)生理生化試驗和PCR試驗鑒定一種飼用益生菌產(chǎn)品中分離的枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis J1220；采用比濁法測定其生長曲線，并確定分離菌株在體外培養(yǎng)對數(shù)生長期末（24h）能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，對于金黃色葡萄球菌ATCC29312和大腸桿菌ATCC25922均有抑制作用

4、，且對革蘭氏陽性菌ATCC29213抑菌性更好；同時通過微量肉湯稀釋法測定分離枯草芽孢桿菌J1220對常見23種抗菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 J1220對大部分常見抗菌藥均敏感，對青霉素G和磺胺類藥物耐藥。
　　2.枯草芽孢桿菌J1220對仔豬血清生化和免疫指標(biāo)及腸道菌群影響研究
　　選擇12頭體重20kg左右的三元雜交去勢仔豬，建立仔豬回腸瘺管模型，經(jīng)過術(shù)后護理及停藥期后將其隨機分為實驗組和對照組，每組6頭；實驗組仔

5、豬飼喂添加益生枯草芽孢桿菌制劑的基礎(chǔ)日糧，對照組飼喂不添加益生菌的基礎(chǔ)日糧，在飼喂后的第0d、7d、14d、28d采集血清測定主要生化和免疫指標(biāo)，結(jié)果顯示在第14d和28d，實驗組血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、肌酸酐（CREA）濃度均顯著增高（P<0.05），同時血清免疫指標(biāo) IgG、IgM和 IgA濃度也顯著增大（P<0.05），而白蛋白與球蛋白比值則顯著降低（P<0.05）；第0d、3d、7d、10d、14

6、d、28d分別采集兩組動物回腸內(nèi)容物和糞便，置于-70℃待檢測，建立實時熒光定量PCR方法對樣品中枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌的含量進行測定，結(jié)果表明隨著實驗組飼喂益生枯草芽孢桿菌的時間增加，腸道及糞便中檢測的枯草芽孢桿菌數(shù)目也隨著增多，實驗組腸內(nèi)容物和糞便中枯草芽孢桿菌的含量從第7d開始顯著增多（P＜0.01），在14d后時基本達到穩(wěn)定狀態(tài)，而對照組腸道與糞便中枯草芽孢桿菌的含量基本無明顯變化；實驗組腸內(nèi)容物乳酸桿

7、菌和雙歧桿菌的含量從第7d開始顯著增多（P﹤0.05），糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量從第10d開始顯著增多（P﹤0.05）；而腸桿菌和腸球菌的含量從第7d開始實驗組腸內(nèi)容物和糞便均顯著低于對照組（P﹤0.05）。
　　3.枯草芽孢桿菌J1220體外代謝研究
　　建立枯草芽孢桿菌代謝物組的LC/MS-IT-TOF檢測方法：首先通過對比樣品出峰完整性及分離度確定 LC/MS-IT-TOF的液相和質(zhì)譜條件，然后根據(jù)單因素對照試驗

8、和正交試驗確立提取溶劑和具體提取方案，考察方法的重復(fù)性后對試驗枯草芽孢桿菌 J1220體外培養(yǎng)對數(shù)生長期末發(fā)酵上清液中的代謝物提取測定，比較它與空白肉湯中的代謝物離子信息的差異；同時建立半體內(nèi)模型考察分離枯草芽孢桿菌與腸道菌群體外共培養(yǎng)情況下差異代謝物離子信息情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動相選擇A相：0.1％甲酸-水（V/V），B相：乙腈，采用梯度洗脫條件能夠使離子峰出峰完全且分離良好；通過單因素對照試驗確定了以體積比為1:1的乙酸乙酯和二氯甲烷混

9、合溶劑，渦旋5min液液萃取的提取方法，方法重復(fù)性考察發(fā)現(xiàn)批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)小于15%，符合試驗要求；試驗在枯草芽孢桿菌 J1220體外培養(yǎng)發(fā)酵上清液與空白肉湯中發(fā)現(xiàn)15種差異代謝物離子信息，分別是 m/z470.2441、474.9189、221.1185、277.1827、316.6631、340.1951、472.8264、453.2828、431.2678、409.2591、443.3213、501.8521、479.8

10、179、460.2983、438.2803；同時建立半體內(nèi)模型發(fā)現(xiàn)，與體外純培養(yǎng)相比，當(dāng)枯草芽孢桿菌 J1220與腸道菌群共培養(yǎng)時，m/z277.1827、340.1951、472.8264、431.2678、409.2591、443.3213、501.8521、479.8179、460.2983、438.2803、416.2708等代謝物信息完全檢測不到，說明在腸道復(fù)雜條件下可能存在的差異代謝物與體外純培養(yǎng)情況不一致，因此建立動物試驗

11、模型進一步驗證。
　　4.枯草芽孢桿菌J1220對仔豬代謝影響研究
　　根據(jù)體外試驗篩選的提取溶劑建立空白腸液、血漿和9種可食性組織樣品前處理方法，并進行方法重復(fù)性考察；通過建立的仔豬回腸瘺管模型在實驗組飼喂枯草芽孢桿菌J1220制劑后的第0d、3d、7d、10d、14d、28d分別采集兩組動物回腸內(nèi)容物和血漿，同時在第28d宰殺動物并采集肝臟、腎臟、肌肉、脂肪、心臟、肺臟、胃、小腸和大腸等可食性組織；采用建立的腸液、血漿及

12、可食性組織樣品前處理方法對動物試驗樣品樣品處理，經(jīng)過LC/MS-IT-TOF檢測后以體外純培養(yǎng)獲得的15種代謝物離子信息為靶標(biāo)提取離子流，考察枯草芽孢桿菌J1220對試驗動物代謝影響。結(jié)果顯示，建立的腸液、血漿和組織樣品代謝物提取和檢測方法重復(fù)性良好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%；檢測仔豬回腸瘺管模型采集的腸液、血漿及可食性組織樣品發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組腸液及血漿中的差異代謝物離子信息分別為 m/z470.2441和m/z474.9189

13、，實驗組動物腸液第3d開始出現(xiàn)差異離子信息，血漿第7d開始出現(xiàn)差異離子信息；而實驗組和對照組第28d組織樣品中僅肝臟、腎臟、小腸、大腸中有明顯的差異，肌肉和胃中離子信息響應(yīng)相對較低，脂肪、心臟、肺臟中未提取到差異離子信息。
　　綜上所述，本課題分離并鑒定了益生枯草芽孢桿菌J1220，測定了其對于23種抗菌藥敏感性以及抑菌活性；建立仔豬回腸瘺管模型現(xiàn)飼喂 J1220益生菌制劑能夠顯著提高仔豬腸道有益菌群數(shù)量而抑制有害菌群數(shù)量，同時經(jīng)