1、該實(shí)驗(yàn)從抗除草劑轉(zhuǎn)基因Bobwhite小麥中,利用PCR克隆的方法擴(kuò)增出bar基因全長(zhǎng),并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),鑒定表達(dá)蛋白的活性,將能夠正確編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶的bar基因片段,經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)男揎棙?gòu)建入真核表達(dá)載體.并將此構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌獲得工程菌,為基因轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化做了前提工作.并對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥體系作了初步的研究,為選育出適宜在安徽麥區(qū)種植的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗除草劑小麥新品種做了基礎(chǔ)工作.該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:1.利用PCR

2、方法對(duì)已知序列基因的克隆是簡(jiǎn)單有效的方法,但很多因素影響PCR的特異性,其中退火溫度起著關(guān)鍵性作用.該實(shí)驗(yàn)采用了高保真pfu DNA聚合酶,在退火溫度61℃條件下從轉(zhuǎn)基因Bobwhite品種基因組DNA中擴(kuò)增出特異性片段,將此片段插入克隆載體pGEM-7fz(+),經(jīng)測(cè)序和序列分析表明,所擴(kuò)增得到的片段含有bar基因完整的讀碼框,并且序列與GenBank中發(fā)表的序列完全一致.2.選用pET32a表達(dá)載體和BL21trxB(DE3)宿主菌

3、的原核表達(dá)系統(tǒng),對(duì)擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行表達(dá)鑒定.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白的分子量39.6kDa,目的片段表達(dá)蛋白分子量20.1kDa,與預(yù)計(jì)的分子量20.0kDa相符.并且表達(dá)的蛋白酶(PAT)經(jīng)DTNB比色法鑒定,具有酶活性.3.為了目的基因在真核生物中有效的翻譯和表達(dá),通過(guò)PCR方法對(duì)bar基因起始密碼子ATG旁側(cè)序列進(jìn)行改造.改造后的目的基因克隆于真核表達(dá)載體pBI121,構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-bar,通過(guò)三親雜交法將真核表

4、達(dá)載體pBI121-bar轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,成功構(gòu)建出工程菌.4.小麥離體培養(yǎng)中,基因型、培養(yǎng)基激素濃度與外植體類型是影響小麥胚性愈傷組織誘導(dǎo)和再生頻率的3個(gè)主要因素.基因型的影響主要影響到胚性愈傷組織的發(fā)生頻率,以幼胚為外植體楊麥87158可以達(dá)到81.35﹪,而安農(nóng)92484只能達(dá)到16.81﹪.在所試的品種中對(duì)于成熟胚在2,4-D質(zhì)量濃度為4.0mg/L時(shí)出愈率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大值,而對(duì)于幼胚不同品種表現(xiàn)有所差異

5、,其中楊麥87158和安農(nóng)98005在2,4-D濃度為2.0mg/L時(shí)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高,而安農(nóng)92484則是在4.0mg/L時(shí)效果較好.同時(shí)研究表明不同外植體不僅影響到出愈率,更主要影響胚性愈傷組織的形成.5.在轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選中,適應(yīng)的PPT篩選濃度為3.0mg/L,Cef有效抑菌濃度為200μg/ml,乙酰丁香酮有效誘導(dǎo)濃度為100μmol/L,0.5﹪表面活性劑Tween20,可以使GUS染色均勻,但并不是T-DNA轉(zhuǎn)