1、綠僵菌作為一類重要的生物防治真菌，可寄生多種昆蟲，在生產中已得到了廣泛應用。據不完全統(tǒng)計，全世界約有兩百多種昆蟲能被這種真菌感染致死。其具有觸殺性，無污染，防止再猖獗等優(yōu)點，但同其他生物農藥一樣，綠僵菌也同時存在殺蟲效果慢、易受環(huán)境影響和效果不穩(wěn)定等缺點，因而一定程度上限制了其大規(guī)模應用。因此，采用基因工程手段對菌株進行改造，提高毒力、殺蟲速度以及抗逆能力成為真菌殺蟲劑研究的重要課題。
　　 目前，許多與毒力、抗逆相關的基因被逐

2、步克隆，包括參與體表附著階段的基因、參與表皮壁水解酶的基因、參與體壁穿透階段的基因以及參與體內定植階段的基因等。這些都為昆蟲病原真菌菌株的改良奠定了良好的基礎。對微生物的分子遺傳改造通常需要對目的基因進行穩(wěn)定重復的表達。利用強啟動子、某時期特異啟動子或可誘導啟動子表達內外源基因對于科學研究與實際應用都有重要的意義。因此，利用高活力的啟動子加強對上述毒力及抗逆基因的表達，是構建高毒菌株的有效策略。
　　 本研究以綠僵菌為實驗材料，

3、在已知序列的基礎上克隆了啟動子的不同5’缺失片段，與報告基因GUS或EGFP融合，通過檢測轉化菌株報告基因轉錄或表達分析組成型啟動子PMagpd和附著胞時期特異啟動子PMagas1的結構和功能。
　　 主要研究結果如下：
　　 1.PMagpd的結構與功能研究
　　 1.1 PMagpd生物信息學分析結果
　　 我們根據綠僵菌基因組序列設計引物，克隆Magpd上游約1700 bp的序列，命名為PMagpd

4、。與其他物種的gpd啟動子進行序列比對，發(fā)現(xiàn)PMagpd啟動子序列內不包含一些常見的順式作用元件TATA-box和CAAT-box。與PgdpA的比對結果顯示，PMagpd內包含一些gpd啟動子共有的順勢作用元件gpd-box，pgk-box，qa-box，qut-box和ct-rich區(qū)域，以及一些可能參與反式作用因子結合的正向、反向重復序列。
　　 1.2轉化子驗證結果
　　 根據PMagpd功能元件的位置，克隆不同

5、長度(1691 bp，1463 bp，946 bp，684bp，405 bp)的PMagpd的5’缺失片段，與GUS基因片段融合插入pK2載體，用農桿菌介導轉化綠僵菌。對初篩轉化子進行PCR和southern blot驗證，PCR驗證結果顯示轉化子為陽性轉化子，雜交結果顯示，轉化子中PMagpd的拷貝數為1到3個不等。
　　 1.3 PMagpd缺失突變分析
　　 通過GUS酶活分析，結果顯示，與包含gpd-box的16

6、91 bp啟動子區(qū)相比，不包含gpd-box的1463 bp的啟動子活性無顯著差異，推測gpd-box對于PMagpd為非必需元件；960 bp和684 bp的啟動子活性分別下降了34％和39％，說明-1463bp～960 bp和-960 bp～-684 bp區(qū)域內存在重要的啟動子元件。將PMagpd與PgpdA比較，活性為PgpdA的1.3倍。RT-qPCR檢測GUS轉錄水平，結果顯示啟動子活性檢測結果與GUS酶活性分析結果一致。

7、r>　　 2.PMagas1的結構與功能研究
　　 2.1 PMagas1生物信息學分析結果
　　 分析綠僵菌Magas1基因組序列，設計引物，克隆Magas1上游調控區(qū)約1228bp的序列，命名為PMagas1。對該調控序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在PMagas1中含有基本啟動子元件CAAT-box，GC-box和TATA-box和真菌啟動子通用元件ct-box以及一些可能與反式作用因子結合相關的正、反向重復序列。<

8、br>　　 2.2轉化子驗證結果
　　 以EGFP為報告基因，采用5’缺失方法構建了不同長度(1228 bp，897 bp，611 bp，377 bp)啟動子的表達載體。通過PCR和Southern blot驗證轉化子，拷貝數為1到3個不等。
　　 2.3 PMagas1的時期特異性研究
　　 對含1228 bp的全啟動子的綠僵菌轉化子各個時期進行EGFP熒光觀察，發(fā)現(xiàn)只有在附著胞階段才能檢測到熒光信號；而在其

9、他生長階段都沒有檢測到信號，包括孢子、萌發(fā)，菌絲和轉化子侵染的蝗蟲期內的蟲生體。說明該啟動子僅在附著胞時期具有活性。
　　 2.4 PMagas1的缺失突變分析
　　 對各個缺失組的轉化子的EGFP基因進行轉錄水平上的定量PCR分析，當缺失了-1228 bp到-897 bp區(qū)域的De12組的活性沒有明顯的下降，而進一步缺失了-897 bp到-611 bp(De13)的序列后，活性下降了接近70％，定點敲除掉-392 bp