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![慢病毒介導IL-1Ra基因對人滑膜細胞體外轉染的研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/c6799e68-99ac-406b-816f-988979d439ff/c6799e68-99ac-406b-816f-988979d439ff1.gif)
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文檔簡介
1、目的骨性關節(jié)炎(OA)是影響中老年人正常生活的常見疾病,其發(fā)病率在60歲以上的人群中,男性為5.6%,而女性為15%,給個人和社會帶來巨大的身心和經濟負擔。在其發(fā)病過程中,大量炎性因子的釋放無疑扮演著重要角色,如IL-1、TNF等。近年來針對這些炎性因子的生物學功能研發(fā)開啟了一系列相關的基因療法,而在這些方法中,滑膜細胞的作用越來越受到重視?;ぜ毎尫诺难装Y介質會造成關節(jié)內軟骨基質的降解,加重炎癥性改變,而其中IL-1Ra是最重要的一
2、種炎癥介質。本實驗中以慢病毒(Lentivirus)介導白介素-1受體拮抗蛋白基因(IL-1Ra)對人膝關節(jié)滑膜細胞進行轉染,試圖以慢病毒介導IL-1Ra基因對滑膜細胞高效的轉染效率及IL-1 Ra基因在滑膜細胞中高效穩(wěn)定的表達、分泌,實現對炎癥介質IL-1的拮抗作用,從而達到抑制軟骨基質降解的目的。
方法體外培養(yǎng)人膝關節(jié)滑膜細胞,以慢病毒介導IL-1Ra表達的重組質粒對對數生長期的人滑膜細胞進行轉染,熒光顯微鏡下觀察其是否能
3、高效轉染,并通過ELISA實驗、免疫組化實驗檢測轉染的基因是否能夠有效表達,最后通過細胞周期的檢測來研究基因轉染對細胞增殖速率的影響。膝關節(jié)表面置換手術中取人體膝關節(jié)滑膜組織,無菌條件下運送至實驗室,培養(yǎng)原代滑膜細胞,經傳代培養(yǎng)(至P2代),細胞得以純化后進行轉染試驗。將P2代細胞分為3組進行對照試驗:A組為慢病毒介導目的基因IL-1Ra進行轉染;B組為陰性對照組,以單純的空白慢病毒載體進行轉染;C組為空白對照組,只作正常的細胞培養(yǎng)。轉
4、染后72h熒光顯微鏡下觀察,以綠色光為激發(fā)光,觀察各組熒光狀態(tài)并計算轉染效率。分別收集A、B、C三組細胞轉染后72h的培養(yǎng)上清液,行ELISA實驗測定各組中IL-1Ra蛋白表達量,分析比較經過慢病毒介導IL-1Ra基因轉染的滑膜細胞是否能夠有效分泌IL-1Ra蛋白。分別收集轉染后72h的A、B、C三組細胞種植于載玻片,置于6孔板內,培養(yǎng)24h后行DAB染色,蘇木素輕度復染,顯微鏡下觀察染色情況,計算各組細胞的IL-1Ra的表達率。
5、> 結果慢病毒介導IL-1Ra基因可高效轉染人膝關節(jié)滑膜細胞,熒光顯微鏡下觀察轉染后72h的滑膜細胞綠色熒光表達強烈,轉染率約為90%。ELISA實驗測定轉染后72h的細胞培養(yǎng)上清含IL-1Ra蛋白A組為(58.723±3.156) ng/ml,B組均為(10.598±3.821)ng/ml,C組均為(11.263±6.833) ng/ml。免疫組化實驗顯示A組細胞約95%胞質內可清楚看到IL-1Ra蛋白顆粒的染色,B、C兩組內幾乎看
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