1、耐輻射球菌是地球上最抗輻射的生物之一，其超強的極端環(huán)境抗性機制，一直是各國研究者的追蹤熱點。目前的研究認為，耐輻射球菌的抗性機制可歸為保護、耐受和修復三個方面。在半個多世紀的研究中，科學家們也試圖尋找耐輻射球菌獨特的機制，來理解該細菌超強的輻射抗性。隨著近幾年自由基生物學的迅猛發(fā)展，研究者認為耐輻射球菌的抗氧化機制是其具有超強電離輻射抗性的主要原因之一，并開展了相關(guān)的研究工作。耐輻射球菌體內(nèi)已有許多抗氧化酶類、抗氧化蛋白、非酶類物質(zhì)被相

2、繼報道了，還不斷有新的成員被發(fā)現(xiàn)。我們認為，開展關(guān)于耐輻射球菌抗氧化機制的研究，不僅有助于我們更好地理解其獨特的逆境抗性，也將對人類疾病的防止與治療有一定的貢獻。本論文研究，以耐輻射球菌的氧化抗性機制為主線，完成了以下三部分的研究工作。 解螺旋酶RecG在生物體中擔任了重要的損傷修復功能，在假單孢菌中發(fā)現(xiàn)該蛋白與氧化抗性相關(guān)。我們通過基因敲除突變的方法，成功獲得耐輻射球菌解螺旋酶RecG功能缺陷的突變株。系列表型實驗結(jié)果顯示，d

3、rrecG基因的缺失引起菌株輻射抗性和氧化抗性的急劇下降，主要是引起菌株細胞提取物清除活性氧自由基的能力大大下降。同時，drrecG基因缺失的突變株MG中過氧化氫酶活性明顯下降，主要以KatB的活性下降最為顯著。脈沖場實驗結(jié)果證實，在氧化脅迫條件下，drrecG的功能缺陷引起菌株基因組的不穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明：drrecG參與了耐輻射球菌的抗輻射損傷和抗氧化的過程；在耐輻射球菌的抗氧化過程中，drrecG對維持基因組穩(wěn)定性和維持過氧化氫

4、酶活性水平具有重要貢獻。我們也研究了突變株MG的基因組轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)drrecG基因缺失引起參與能量代謝過程中的成員基因異常上調(diào)，核糖體蛋白基因被大量的抑制。我們認為drrecG的缺陷，可能導致了耐輻射球菌內(nèi)部能量代謝的紊亂，這也是突變株MG在指數(shù)生長期出現(xiàn)明顯的生長遲滯現(xiàn)象的原因之一。在低濃度的過氧化氫脅迫條件下，drrecG基因的缺失激起了大量損傷修復蛋白、損傷識別蛋白、抗氧化蛋白的基因上調(diào)，表明突變株MG經(jīng)歷了極其嚴峻的生存考驗。

5、上述結(jié)果再次證明drrecG基因是一個參與氧化抗性及損傷修復的重要因子。 dr1127基因的發(fā)現(xiàn)，源于我們實驗室開展的耐輻射球菌基因組芯片工作和蛋白質(zhì)組雙向電泳研究。在野生株R1經(jīng)過2,000Gy輻照處理后，dr1127基因及其產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的上調(diào)狀態(tài)。該基因的生物信息分析顯示，dr1127基因可能與一些毒性離子的抗性有關(guān)。我們通過敲除dr1127基因的突變株，研究該基因在耐輻射球菌體內(nèi)的生物學功能。dr1127基因缺陷株的逆境

6、存活率結(jié)果顯示，該基因的敲除引起菌株抵抗輻射損傷和氧化損傷的能力顯著下降，表現(xiàn)為過氧化氫極度敏感。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，以上現(xiàn)象的發(fā)生主要由于dr1127基因的缺失引起菌體細胞清除活性氧自由基的能力下降。菌體抗氧化酶活性測定結(jié)果顯示，dr1127基因突變株中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性較野生株的分別下降了302.23％和20.18％。以上結(jié)果顯示，dr1127基因是耐輻射球菌體內(nèi)維持輻射抗性和氧化抗性的重要基因，其在抗氧化過程中的作用可能

7、部分來自其對抗氧化酶活性的調(diào)控。同時，我們在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達并純化得到46KD的DR1127蛋白產(chǎn)物。在Fe<'2+>和H<,2>O<,2>組成的氧化損傷系統(tǒng)中，DR1127蛋白的加入可以有效地防止氧化損傷引起的DNA鏈缺口斷裂以及片段斷裂的情況。同時，我們在實驗中觀察到一個有趣的現(xiàn)象：隨著DR1127蛋白添加量的增加，DNA在泳道中出現(xiàn)逐漸明顯的拖帶現(xiàn)象。蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合活性實驗結(jié)果顯示，DR1127蛋白可以結(jié)合雙鏈DNA，隨

8、著蛋白量的增加，DR1127蛋白可以實現(xiàn)完全綁定DNA的功能。以上結(jié)果很好地解釋了DR1127蛋白可能的生物學功能，在體外DR1127蛋白能夠與DNA結(jié)合形成致密的蛋白質(zhì)-DNA復合物，通過這種方式可以有效防止自由基直接攻擊DNA分子，減少：DNA損傷情況。 作為維生素A的前體，類胡蘿卜素本身具有抗氧化以及其他多種生物學功能。隨著類胡蘿卜生理、藥理功能認識的深入和在臨床醫(yī)學、食品工業(yè)及化妝品工業(yè)等方面的應(yīng)用與研究，促進了類胡蘿卜

9、素的市場發(fā)展和工業(yè)化生產(chǎn)。目前已有很多微生物被用作發(fā)酵制取類胡蘿卜素的研究報道，而耐輻射球菌作為一種原核微生物，具有生長周期短(30h左右，霉菌需要72-96h)、菌體破碎較容易、提取方法簡便、便于發(fā)酵控制等特點，這在很大程度上滿足了大規(guī)模生產(chǎn)類胡蘿卜素的要求。通過研究，我們找到了以豆餅粉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并適當?shù)难a充碳源(蔗糖)和氮源(硝酸鹽)取代了價格較高的的TGY(蛋白胨-葡萄糖-酵母膏)培養(yǎng)基，取得了很好的效果，而且從成本角度考慮更