1、低溫敏感性啟動(dòng)子是一類特殊的啟動(dòng)子，它們?cè)诘蜏叵碌霓D(zhuǎn)錄強(qiáng)度高于常溫下的。低溫下表達(dá)外源蛋白，可以增加蛋白的可溶性；一些熱敏感的蛋白非常適合低溫表達(dá)。自然界的低溫敏感性啟動(dòng)子數(shù)量較少。為了研究這類啟動(dòng)子的特點(diǎn)，以及構(gòu)建新型的低溫表達(dá)載體，本課題運(yùn)用人工啟動(dòng)子文庫(kù)（SPL）技術(shù)，篩選人工的低溫敏感性啟動(dòng)子，并對(duì)這些啟動(dòng)子進(jìn)行研究。
　　 建立了適合低溫敏感性啟動(dòng)子篩選的方法。通過對(duì)比研究抗性基因kan和綠色熒光蛋白基因EGFP各自做

2、報(bào)告基因時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)，確認(rèn)采用EGFP基因?yàn)楸菊n題中啟動(dòng)子的報(bào)告基因。建立了簡(jiǎn)便的雙層平板誘導(dǎo)法對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行初篩。
　　 通過分析對(duì)比大腸桿菌中四種冷激蛋白基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)了隨機(jī)的人工啟動(dòng)子序列，運(yùn)用反向PCR技術(shù)建立了包含1500個(gè)以上轉(zhuǎn)化子的人工啟動(dòng)子文庫(kù)。初篩后獲得106個(gè)有效啟動(dòng)子；復(fù)篩后得到17個(gè)低溫敏感性啟動(dòng)子；測(cè)序后確認(rèn)了7個(gè)不同的低溫敏感性啟動(dòng)子。
　　 選擇溫度敏感性較好的強(qiáng)啟動(dòng)子P129和弱啟動(dòng)子

3、P3分別進(jìn)行了特征測(cè)定。分析過程中以天然的低溫敏感性啟動(dòng)子PCspA為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)P129和P3各方面的特性均與PCspA類似。最佳表達(dá)溫度為15 ℃；持續(xù)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)45 h；最佳表達(dá)的菌齡在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期（OD600為0.4左右）。以D15基因檢驗(yàn)了P129和P3的表達(dá)蛋白的效果。發(fā)現(xiàn)P3啟動(dòng)子的效果與用熒光蛋白檢測(cè)的結(jié)果一致，即表達(dá)強(qiáng)度弱于PCspA啟動(dòng)子。另外，比對(duì)D15基因在T7啟動(dòng)子下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)低溫敏感性啟動(dòng)子未形成包涵體