1、目的：探討先天性房、室間隔缺損患者GATA-4基因突變情況以及其基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系；研究漢族先天性房、室間隔缺損患者GATA-4基因兩個(gè)突變點(diǎn)的功能。 方法：選擇50例漢族先天性房、室間隔缺損患者和100例漢族健康者，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增GATA-4基因6個(gè)外顯子編碼區(qū)及兩側(cè)各50個(gè)堿基以上的序列，PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)ABI PRISM3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀自動(dòng)測(cè)序，然后與NCBI數(shù)據(jù)庫中GATA-4基因的

2、序列進(jìn)行比對(duì)，并與健康對(duì)照組比較，觀察GATA-4基因突變情況；利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)GATA-4基因點(diǎn)突變對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響；以野生型pcDNA3.1-GATA-4為模板，用基因定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建突變型真核表達(dá)載體；在體外和ANF luciferase報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48小時(shí)后檢測(cè)下游ANF-Luciferase報(bào)告基因的活性。 結(jié)果：⑴找到GATA-4基因三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。除了在第2號(hào)外顯子上第196位核苷酸發(fā)

3、現(xiàn)存在G→A轉(zhuǎn)換(c. G196A)，導(dǎo)致相應(yīng)的第66位的丙氨酸(Ala)被蘇氨酸(Thr)取代(Ala66Thr)，而SNP庫報(bào)道rs1139244第196位核苷酸G→C顛換(c.G196C)，導(dǎo)致相應(yīng)的第66位的丙氨酸(Ala)被脯氨酸(Pro)取代(Ala66Pro)以外，rs1062215和rs804280二個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的完全一致。⑵發(fā)現(xiàn)GATA-4基因兩個(gè)新的雜合子突變，分別位于第2號(hào)外顯子

4、的His28Tyr和位于第7號(hào)外顯子的His436Tyr，在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中均未見報(bào)道且在100例對(duì)照組中也未發(fā)現(xiàn)。⑶GATA-4基因編碼第28位和第436位組氨酸在生物進(jìn)化過程中均處于高度保守。⑷SIFT和PolyPhen程序預(yù)測(cè)GATA-4基因His28Tyr和His436Tyr兩個(gè)點(diǎn)突變都可能影響它的蛋白質(zhì)功能。⑸PcDNA3.1-GATA-4突變型真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)正反兩個(gè)方向進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功。⑹GATA-4基因His2

5、8Tyr突變型質(zhì)粒激活下游ANF luciferase報(bào)告基因的活性與野生型GATA-4質(zhì)粒相比是(112±6.9)％，沒有顯著性差異(P>0.05)；而GATA-基因His436Tyr突變型質(zhì)粒激活下游ANF luciferase報(bào)告基因的活性明顯下降，與野生型GATA-4質(zhì)粒相比是(53.8±6.6)％，具有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：①轉(zhuǎn)錄因子GATA-4基因突變可能與漢族先天性房、室間隔缺損發(fā)生有關(guān)。②PcDNA