1、目的:探討先天性心臟病中CITED2基因突變的致病機制即對轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達的影響，同時檢測先天性心臟病患兒CITED2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化情況，并進一步研究CITED2基因的轉(zhuǎn)錄水平的改變，探討其與先天性心臟病的發(fā)生的相關(guān)性。
　　方法:將成功構(gòu)建的CITED2(c.573-578de16)突變重組質(zhì)粒及CITED2野生型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HepG2及H9C2細胞中，置于低氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時，分別提取RNA，檢

2、測HIF-1α的mRNA的表達差異。同時48小時后提取蛋白，檢測HIF-1α蛋白的表達差異。收集31例先天性心臟病患兒及2例意外死亡兒童的右心耳組織，分別提取組織基因組DNA，采用亞硫酸氫鹽修飾試劑盒對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽的修飾后并保存。利用生物信息學軟件分析篩選其中兩段，分別采用亞硫酸氫鹽修飾結(jié)合測序法（BSP法）及甲基化特異性PCR法(MSP法)進行甲基化的檢測。提取甲基化組及未甲基化組RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用實時熒光

3、定量PCR法檢測兩組CITED2基因mRNA水平的表達差異。
　　結(jié)果:
　　1.HepG2及H9C2細胞中均存在，HIF-1α的mRNA的表達:野生組與空載體組相比，表達量明顯降低(P＜0.05);突變組表達量高于野生組（P＜0.05）;而空載體組與未轉(zhuǎn)染組相比，未見明顯差異。
　　2.HepG2及H9C2細胞中均存在，HIF-1α蛋白的表達:野生組與空載體組相比，表達量明顯降低(P＜0.05);突變組均高于野生組，

4、差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);空載體組與未轉(zhuǎn)染組相比，未見明顯差異。
　　3.采用BSP法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):在克隆測序成功的12例先天性心臟病心肌組織中，有10例發(fā)現(xiàn)存在甲基化，甲基化陽性率為83％(10/12)。
　　4.采用MSP法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):在19例先天性心臟病心肌組織中發(fā)現(xiàn)16例存在甲基化，甲基化陽性率為84％(16/19)。
　　5.對照組甲基化檢測陽性率均為0％。
　　6.實時熒光定量PCR檢測結(jié)

5、果顯示甲基化組與對照組相比CITED2基因mRNA表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1.CITED2能反饋的抑制HIF-1α的表達。
　　2.CITED2突變后使得CITED2對HIF-1α的負反饋抑制作用減弱。
　　3.CITED2基因突變引起的HIF-1α的過表達可能是促進先天性心臟病的發(fā)生的因素之一。
　　4.先天性心臟病中存在CITED2基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化的改變，