1、水牛具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫高濕、抗病力強(qiáng)、耐粗飼、容易飼養(yǎng)、使用年限長等優(yōu)點(diǎn),非常適合我國南方農(nóng)村飼養(yǎng),是我國南方極具開發(fā)價值的大家畜?？谔阋呤且环N由口蹄疫病毒引起的以侵害偶蹄動物為主的急性、熱性、高度接觸性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織列為A類動物傳染病。為應(yīng)用水牛RNA聚合酶III啟動子進(jìn)行基因沉默研究,探討應(yīng)用RNAi沉默水牛口蹄疫病毒的可行性,本研究對水牛的7SK和U6啟動子進(jìn)行了克隆與活性分析,并應(yīng)用其構(gòu)建了多啟動子串聯(lián)RNAi抗口

2、蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因小鼠模型,取得了如下的研究結(jié)果:
　　1、水牛7SK和U6啟動子克隆與功能分析。參考牛的基因組序列,設(shè)計特異性擴(kuò)增引物,成功克隆了長430 bp和357 bp的水牛7SK(Genbank序列號:JN417658)和U6啟動子(Genbank序列號:JN417659)。為對比不同物種 polIII啟動子的活性,本研究還克隆了人、豬和牛的7SK和U6啟動子?？寺〉膯幼优c針對 EGFP的短發(fā)卡 RNA(shRNA)雙鏈

3、DNA片段(shEGFP)相連接,成功構(gòu)建8個EGFP沉默表達(dá)載體(pbu7SK-shEGFP、pbuU6-shEGFP、 ph7SK-shEGFP、 phU6-shEGFP、 pbo7SK-shEGFP、pboU6-shEGFP、pp7SK-shEGFP和ppU6-shEGFP)。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFF),轉(zhuǎn)染后72小時通過莖-環(huán)QRT-PCR檢測細(xì)胞RNA中的shEGFP相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,以 h7SK-shE

4、GFP組為100％, bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP組中的shEGFP含量高達(dá)257.17%(±33.79%)和174.67%(±32.94%),表明水牛7SK和U6啟動子能啟動shEGFP在細(xì)胞中高效表達(dá)。將構(gòu)建的載體與pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染水牛和小鼠細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后60 h在熒光顯微鏡下可觀察到共轉(zhuǎn)shEGFP表達(dá)載體的細(xì)胞發(fā)生了明顯的熒光表達(dá)沉默現(xiàn)象;轉(zhuǎn)染后72 h的BFF流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)入pbu7SK-shE

5、GFP和pbuU6-shEGFP的細(xì)胞中沉默EGFP效果顯著高于其它各組,沉默效率高達(dá)93.82%(±0.16%)和87.45%(±0.52%)(p<0.05)。QRT-PCR的檢測結(jié)果顯示,pEGFP-N1與 bu7SK-shEGFP共轉(zhuǎn)染水牛細(xì)胞的EGFP表達(dá)水平(下降93.29%±1.30%)和buU6-shEGFP共轉(zhuǎn)染的EGFP表達(dá)水平(下降93.45%±1.25%)差異不顯著(p>0.05),兩者的EGFP表達(dá)水平均顯著低于

6、其它物種啟動子的共轉(zhuǎn)染組(p<0.05)。在小鼠細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染bu7SK-shEGFP的EGFP沉默效率最高(下降91.29±1.03%)。上述結(jié)果表明,克隆得到的水牛7SK、U6啟動子可以高效啟動shRNA的表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生沉默目的基因的RNA。
　　2、多shRNA串聯(lián)抗口蹄疫病毒RNAi載體的構(gòu)建。首先針對口蹄疫病毒3B和3D保守區(qū)域設(shè)計并化學(xué)合成三個shRNA串聯(lián)片段,然后分別連接水牛7SK、水牛U6和牛U6啟動子,構(gòu)建成b

7、u7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3三個shRNA串聯(lián)表達(dá)盒,并連接入慢病毒載體質(zhì)粒pSicoR構(gòu)建成抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因載體 pSicoR-3shRNA(用 CMV啟動的EGFP作為標(biāo)記基因)。利用慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)pNRF、pVSVg和pSicoR-3shRNA共轉(zhuǎn)于293T細(xì)胞包裝成慢病毒顆粒,然后感染BHK-21細(xì)胞,獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,通過莖環(huán)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的針對口蹄疫病毒的三個shRNA表達(dá)。

8、為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和慢病毒載體的口蹄疫病毒抗性,首先將 O型口蹄疫病毒接種入表達(dá)抗口蹄疫shRNA的BHK-21轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中,觀察比較接毒后48 h內(nèi)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中口蹄疫病毒復(fù)制情況,同時分別將滴度為1000、100、20和5 LD50的O型FMDV毒株接種于抗口蹄疫慢病毒載體預(yù)處理過的3~5日齡乳鼠(LV),以接毒 PBS預(yù)處理乳鼠作為對照(NC)。細(xì)胞抗性結(jié)果顯示,與普通細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在接種病毒后6 h到48 h內(nèi)對口蹄疫病毒的復(fù)

9、制有明顯的抑制,其中在接種后24 h抑制效果最佳,高達(dá)67.48%。小鼠抗性結(jié)果顯示,接毒后72 h內(nèi)NC組在5 LD50滴度下有2只乳鼠發(fā)病死亡,在20 LD50滴度下無乳鼠存活,而LV組在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活,在20 LD50滴度下仍有三只乳鼠存活至第7天,且LV組在各滴度內(nèi)死亡乳鼠的存活時間相比 NC組均有所延長。上述結(jié)果表明,構(gòu)建的多shRNA串聯(lián)表達(dá)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因載體能提高BHK-21細(xì)胞和乳鼠對口蹄疫病毒的抵抗力

10、,有效地避免了5 LD50滴度內(nèi)乳鼠的死亡現(xiàn)象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能。
　　3、多shRNA串聯(lián)抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備:將抗口蹄疫多 shRNA串聯(lián)表達(dá)盒 bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-CMV-EGFP片段純化后顯微注射到小鼠的受精卵中獲得27只小鼠,經(jīng)PCR檢測,7只為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。選擇其中兩只表達(dá) EGFP的親代小鼠分別傳代至F6~7代,經(jīng)PCR和South

11、ern blotting檢測,每代每窩的陽性小鼠比例約為50%~60%,表明轉(zhuǎn)基因小鼠中整合的目的片段具有良好的遺傳穩(wěn)定性。通過激光共聚焦顯微鏡對F0-7和F0-14兩個親本小鼠的F3后代各組織的冰凍切片進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)在F0-14小鼠后代心、脾、腎的組織可見較強(qiáng)的熒光表達(dá),而在F0-7小鼠后代只有脾臟表達(dá)的熒光略強(qiáng)于前者,其余組織表達(dá)熒光均相對F0-14后代較弱。通過莖環(huán)RT-PCR對兩個親本組織中三個抗口蹄疫shRNA表達(dá)量進(jìn)行測定,

12、在F0-14中三個shRNA的表達(dá)水平均高于F0-7。選擇F0-14的后代作為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠代表進(jìn)行抗病毒能力檢測試驗(yàn),將轉(zhuǎn)基因陽性及普通乳鼠分別頸后皮下注射1000 LD50、100 LD50、20 LD50和5 LD50的O型 FMDV0.2 mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn),接毒72 h后1000 LD50、100 LD50、20 LD50滴度下轉(zhuǎn)基因及普通乳鼠均無存活,而在5 LD50滴度組內(nèi)轉(zhuǎn)基因乳鼠死亡數(shù)量低于普通組。為進(jìn)一步確認(rèn)這一結(jié)果,分

13、別用20 LD50和5 LD50滴度的O型 FMDV注射10只乳鼠,發(fā)現(xiàn)注射5 LD50滴度的普通乳鼠僅存活3只(30%),而轉(zhuǎn)基因乳鼠存活8只(80%)。在乳鼠死亡后或接毒后72 h分別對胴體、心臟、肝臟及腎臟中的FMDV病毒量進(jìn)行Q-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)死亡的轉(zhuǎn)基因乳鼠各組織的病毒量并沒有低于普通組,而存活的轉(zhuǎn)基因乳鼠各組織內(nèi)FMDV病毒量略低于存活的普通小鼠。
　　上述研究結(jié)果為進(jìn)一步建立抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因水牛提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù),