1、纖維素是自然界中數(shù)量最龐大的可再生資源，它的降解不僅構(gòu)成了自然界碳循環(huán)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而且為生物燃料的生產(chǎn)提供了一個(gè)潛在的應(yīng)用空間。然而，由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)特殊，由此形成的抗生物降解屏障使其轉(zhuǎn)化加工過程的成本居高不下，構(gòu)成了利用纖維素材料生產(chǎn)生物能源的最大瓶頸。以瑞氏木霉為代表的腐生多細(xì)胞真菌，具有很強(qiáng)的分泌纖維素酶的能力，是研究纖維素降解的主要模式生物。在纖維素底物存在的條件下，它能夠大量分泌三種協(xié)同降解纖維素的酶：內(nèi)切葡聚糖酶，纖維

2、二糖水解酶，β-葡萄糖苷酶。其中內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解纖維素鏈中的糖苷鍵，產(chǎn)生大量不同聚合度的纖維素短鏈；外切酶(纖維二糖水解酶)可以從纖維素鏈的還原端(CBHⅠ)或非還原端(CBHⅡ)開始持續(xù)水解單根纖維素糖鏈，釋放纖維二糖并由此破壞纖維素的結(jié)晶區(qū)；β-葡萄糖苷酶則主要水解纖維二糖和可溶性纖維寡糖，最終將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的葡萄糖。與內(nèi)切酶和外切酶的結(jié)構(gòu)、功能的研究和分析相比，β-葡萄糖苷酶的研究較少。200

3、8年公布的瑞氏木霉基因組序列測定結(jié)果表明，除已知的纖維素內(nèi)切酶和外切酶外，還包括多達(dá)7種的β-葡萄糖苷酶。而且這些β-葡萄糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄水平存在著明顯差異。盡管研究表明β-葡萄糖苷酶是纖維素降解為單糖所必須的，但是如此眾多的β-葡萄糖苷酶在瑞氏木霉利用纖維素過程中的功能和作用機(jī)制還不明確。
　　 除上述已知的纖維素酶活性組分外，包括瑞氏木霉在內(nèi)的纖維素產(chǎn)生菌在纖維素存在的條件下往往也會(huì)產(chǎn)生一些無明顯水解活性或活性較低的誘導(dǎo)表達(dá)

4、組分。其中纖維膨脹因子(Swollenin)是一類與植物細(xì)胞壁擴(kuò)展因子(Expansin)具有一定同源性，但同時(shí)具有纖維素酶典型結(jié)構(gòu)域組成的非水解活性蛋白，與Expansin能疏松和破壞植物細(xì)胞壁中的多聚糖(例如纖維素和半纖維素)間的相互聯(lián)接類似，Swollenin雖不水解纖維素但能夠使棉纖維和濾紙發(fā)生膨脹。其精確的作用機(jī)制，尤其是其在纖維素水解過程中與纖維素酶潛在的協(xié)同作用及協(xié)同機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
　　 針對以上兩個(gè)方面，

5、我們建立了黑曲霉外源蛋白表達(dá)體系，在黑曲霉中表達(dá)并純化了Swollenin，對其性質(zhì)及其與纖維素酶在催化水解纖維素過程中的協(xié)同水解活性進(jìn)行了初步研究；對瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cellb及其催化活性相關(guān)氨基酸的點(diǎn)突變體進(jìn)行了表達(dá)純化，分析了其水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性，同時(shí)構(gòu)建了β-葡萄糖苷酶cella和cellb基因的敲除菌株，研究了其在瑞氏木霉利用纖維素過程中對纖維素酶表達(dá)的影響。本論文主要的創(chuàng)新研究結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建了帶有

6、多克隆位點(diǎn)的黑曲霉通用表達(dá)質(zhì)粒，獲得了擬康氏木霉Swollenin全蛋白(SWO2)及各種結(jié)構(gòu)域缺失突變體蛋白的表達(dá)菌株。
　　 為了建立Swollenin高水平表達(dá)體系，獲得大量的Swollenin蛋白用于其性質(zhì)研究，構(gòu)建了以葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子glaA和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶基因(trpC)的終止子為控制元件，以pyrG為轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的通用表達(dá)載體。其中在啟動(dòng)子的后面融合了6×His和流感血凝素(HA)串聯(lián)標(biāo)簽以及多克隆位點(diǎn)，6

7、×HisHA有利于純化和鑒定目的蛋白，而多克隆位點(diǎn)有利于插入各種要表達(dá)的目的蛋白。將SWO2全蛋白基因及各種功能結(jié)構(gòu)域突變蛋白的基因片段連接到上述質(zhì)粒中，得到表達(dá)質(zhì)粒。利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化黑曲霉MGG029，經(jīng)過復(fù)篩，單孢分離和Western blot檢測，獲得了目的蛋白表達(dá)量較高并且能夠穩(wěn)定表達(dá)的菌株。
　　 2.從黑曲霉 MGG029發(fā)酵液中純化獲得了Swollenin全蛋白，對重組表達(dá)的Swollenin與纖

8、維素酶的協(xié)同作用活性進(jìn)行了研究。
　　 為了研究Swollenin的性質(zhì)，首先建立了重組表達(dá)的SWO2的純化方法。黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液依次經(jīng)過陰離子交換柱層析(Q Sepharose fast flowcolumn)和疏水層析(TSK-gel phenyl-5PW)分離而得到純酶組分，質(zhì)譜分析鑒定確定了所純化的組分為目的蛋白SWO2。1L發(fā)酵液經(jīng)過上述簡單的分離步驟可以獲得約10 mg的純化目的蛋白。EndoHf處理重組Swo

9、llenin后分子量僅發(fā)生輕微的減小，表明所獲得的Swollenin蛋白可能不只發(fā)生N-糖基化，其它的蛋白修飾如O-糖基化等也是重要的影響因素；與煙曲霉AfSwol較低的CMC酶活(2.6U/mg)相比，純化的Swollenin在以Avicel(PH101)，CMC，RAC為底物時(shí)測得的酶活更低。在低纖維素酶使用劑量(0.08～0.09 FPU/g纖維素)的條件下，采用與Swollenin同時(shí)處理纖維素和先后處理兩種方法檢測協(xié)同活性，結(jié)

10、果表明先后處理的協(xié)同活性最高可比同時(shí)處理時(shí)高出近一倍，推測可能是由于Swollenin可先對纖維素表面進(jìn)行了某種修飾，從而促進(jìn)了后續(xù)纖維素酶的催化水解作用。Swollenin中哪一結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了纖維素表面結(jié)構(gòu)的修飾變化以及此種變化的性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。
　　 3.表達(dá)純化了瑞氏木霉Cellb及其催化活性相關(guān)氨基酸的點(diǎn)突變體，對其水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性進(jìn)行了研究。
　　 研究表明某些第一家族的β-葡萄糖苷酶具有轉(zhuǎn)糖基活性，為

11、深入研究瑞氏木霉中β-葡萄糖苷酶的功能性質(zhì)，我們首先根據(jù)瑞氏木霉Cella的晶體結(jié)構(gòu)，同源模建了瑞氏木霉Cellb的三維結(jié)構(gòu)；同時(shí)根據(jù)糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的序列比對，發(fā)現(xiàn)糖基綁定位點(diǎn)周圍的殘基具有很強(qiáng)的保守性，而糖苷配基綁定位點(diǎn)周圍的殘基保守性較低。針對糖苷配基綁定位點(diǎn)周圍不保守的殘基，設(shè)計(jì)構(gòu)建了五個(gè)Cellb的突變體。進(jìn)一步表達(dá)純化了Cellb及其催化活性相關(guān)氨基酸的點(diǎn)突變體，并對其水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明

12、，Cellb在高底物濃度條件下具有很明顯的轉(zhuǎn)糖基活性，可以將部分葡萄糖轉(zhuǎn)化為纖維二糖，將部分纖維二糖轉(zhuǎn)化為纖維三糖和纖維四糖。與野生型蛋白相比，1174C和D242H突變體蛋白的比酶活有所上升，而Y178L，S442A和H265A突變體蛋白的比酶活基本不變。其中，1174C突變體蛋白的比酶活是野生型蛋白的143倍，結(jié)合其晶體結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，推測174位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼岷髮?dǎo)致催化效率提高而使酶活提高，該位點(diǎn)突變導(dǎo)致的水解活性

13、的變化為構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶以及高活性纖維素酶系統(tǒng)提供了一條新思路。
　　 4.對cella和cellb進(jìn)行了體內(nèi)同源重組敲除，研究了二者在瑞氏木霉利用纖維素過程中對纖維素酶表達(dá)的影響。
　　 為了獲得cella和cellb基因的缺失菌株，構(gòu)建了相關(guān)同源敲除盒，轉(zhuǎn)化重組到瑞氏木霉基因組上后得到了cella和cellb的基因敲除菌，觀察其在纖維二糖平板和球磨纖維素平板上的生長情況，發(fā)現(xiàn)cella和cellb基因敲除菌株在纖維二

14、糖平板上的生長較野生型菌株QM9414明顯受到了抑制，其中△cella菌株△cellb菌株生長更慢，推測可能是由于Cella和Cellb作為胞內(nèi)主要的β-葡萄糖苷酶，其酶活的喪失使細(xì)胞無法有效地代謝纖維二糖進(jìn)行正常生長。在球磨纖維素平板上，△cella菌株與△cellb菌株的水解圈都比野生型菌株QM9414小，其中△cella菌株的水解圈最小。將野生型菌株QM9414及兩種基因缺失菌株△cella菌株和△cellb菌株分別在結(jié)晶纖維素A

15、vicel為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)初期，兩種基因敲除菌分泌的蛋白量明顯低于野生型菌株QM9414，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，蛋白分泌量逐漸提高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)晶纖維素 Avicel培養(yǎng)基中，上述兩種基因缺失菌株發(fā)酵液的外切酶酶活隨時(shí)間的延長而提高，但△cella菌株和△cellb菌株的外切酶酶活明顯比野生型菌株QM9414低，且與野生型菌株相比，△cella菌株和△cellb菌株在誘導(dǎo)條件下發(fā)酵液的等量總蛋白中的外切酶酶活

16、單位數(shù)較低，表明兩種基因缺失菌分泌的外切酶在總蛋白中的比例比野生型要低。與野生型菌株相比，在Avicel誘導(dǎo)條件下，cella&cellb基因的缺失導(dǎo)致主要纖維素酶基因cbhI的轉(zhuǎn)錄延遲，其中△cella菌株中cbhI的轉(zhuǎn)錄延遲了9 h，直到12h有轉(zhuǎn)錄；△cellb菌株中cbhI的轉(zhuǎn)錄延遲了3h。以上結(jié)果與這兩個(gè)基因缺失突變株在以Avicel為碳源的平板上產(chǎn)生水解圈的大小相一致，進(jìn)一步表明cella和cellb兩個(gè)基因的敲除影響了纖維