1、背景和目的：大腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一。目前對于晚期大腸癌或術后復發(fā)轉移的病例，尚無有效的治療手段。研發(fā)大腸癌高效的腫瘤疫苗，是目前的研究熱點之一，現(xiàn)也已被視為未來提高其臨床治愈率的希望所在。本課題結合表位生物學進展和臨床病理學基礎，提出針對大腸癌的新型CEA疫苗設計方案：以CEAHLA-A2限制性CTL表位與PADRE(非天然通用Th表位)作為CEA疫苗的融合治療表位，以人類乳頭狀病毒16型晚期結構蛋白(HPV16L1)作為CEA

2、疫苗的蛋白載體，并以安全、高效的真核細胞表達體系——BactoBac桿狀病毒表達系統(tǒng)來表達重組蛋白。在疫苗的設計上，兼顧了安全性和高效性，綜合利用各組分的免疫特性，使之可能發(fā)揮協(xié)同作用，有利于打破機體對CEA的免疫耐受，激發(fā)高效、持久的CTL反應，從而為大腸癌的治療探索新的方法。 方法：1、根據(jù)HPV16L1基因圖譜和其蛋白形成病毒性顆粒的結構特性，設計含有限制性內切酶SalⅠ和NotⅠ位點的引物，選擇性從質粒114KLlpFa

3、stBac1擴增HPV16ΔL1片段(去除編碼其C末端34個氨基酸殘基的序列)，并將其連入T載體。2、采取定向克隆的方法，將HPV16ΔL片段克隆到空載體pFastBacl的SalⅠ和NotⅠ位點，構建中間質粒HPV16ΔL1pFastBac1，并測序驗證。3、設計、合成含有限制性內切酶NotⅠ和XbaⅠ位點的編碼CEAHLA-A2限制性CTL表位和通用性Th表位PADRE的可退火引物，將其克隆至中間質粒HPV16ΔL1pFastBac

4、l的相應酶切位點，構建新型CEA疫苗的重組桿狀病毒轉移質粒，測序并酶切鑒定。4、用重組桿狀病毒轉移質粒轉化感受態(tài)菌株DH10Bac，通過轉座效應得到融合表位疫苗的重組桿狀病毒表達載體。5、用脂質體介導轉染Sf9細胞，并通過PCR鑒定重組桿狀病毒。6、采用免疫組化染色檢測45例大腸癌中HPV16殼蛋白抗原(HPV16L1)、P53、PCNA的表達。 結果：1、對克隆的HPV16ΔL1片段的PCR擴增產物進行電泳，在1.6kb附近見

5、到一特異性條帶，表明HPV16ΔL1片段克隆成功。2、重組桿狀病毒轉移質粒經SalⅠ和XbaⅠ雙酶切后，得到目的片段和載體片段，測序結果符合設計序列，表明連接成功。3、提取感染重組桿狀病毒的Sf9細胞DNA后，PCR證實其產物為所需序列。4、大腸癌中HPV16L1陽性表達46.7％(21/45)，在性別、臨床分期、組織類型和分化程度之間差異均不顯著；大腸癌中p53陽性表達53.3％(24/45)，其中13例HPV16感染，兩者無明顯相關

6、性(P=0.286＞0.05)。大腸癌中PCNA高表達75.6％(34/45)，其中19例HPV16感染，PCNA高表達和HPV16感染呈正相關(P=0.031＜0.05)；在大腸癌中，P53蛋白表達與PCNA高表達呈正相關(P=0.008＜0.05)。 結論：1、我們成功克隆了HPV16片段。2、通過定向克隆成功地構建了新型CEA疫苗重組桿狀病毒轉移質粒。3、轉染Sf9細胞后，成功獲得新型CEA疫苗的重組桿狀病毒。4、HPV1