1、轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物發(fā)育以及抗逆功能基因的表達(dá)中具有重要作用，其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物的器官發(fā)育、形態(tài)建成、器官分離、葉片衰老以及非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子是一類特殊的轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下，它以膜結(jié)合的形式存在于細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)（細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或核膜）上，處于非活性狀態(tài)。在受到外界信號(hào)刺激后，通過蛋白水解機(jī)制從膜上釋放下來，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘男问竭M(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。目前，有關(guān)玉米NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)

2、錄因子（ZmNTLs）的功能研究尚未見報(bào)道。本研究從玉米基因組中，發(fā)掘出了7個(gè)ZmNTLs基因，對(duì)它們的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、系統(tǒng)進(jìn)化樹、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性、組織特異性表達(dá)及其對(duì)非生物脅迫及激素響應(yīng)特性進(jìn)行了研究，獲得了擬南芥35S::ZmNTL1、35S::ZmNTL2和35S::ZmNTL5純系，并分別研究了ZmNTL1，-2在調(diào)控?cái)M南芥水淹脅迫響應(yīng)和木質(zhì)素合成中的作用。
　　主要研究過程及實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括：
　?。?）玉米N

3、AC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子ZmNTLs序列、表達(dá)特征分析
　　利用生物信息學(xué)方法，從216個(gè)玉米NAC轉(zhuǎn)錄因子中篩選出7個(gè)具有跨膜結(jié)構(gòu)域的成員，確定為玉米NAC膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（ZmNTL），并命名為ZmNTL1-7。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所有的玉米NTLs N-末端均具有典型的NAC結(jié)構(gòu)域，C-末端均具有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)，將7個(gè)ZmNTLs分成4個(gè)組（包括3個(gè)基因?qū)Γ?，分別為ZmNTL1/5、ZmNTL2/3、ZmNTL6/7和

4、ZmNTL4。
　?。?）ZmNTLs進(jìn)化分析
　　利用MEGA6.0對(duì)來自擬南芥的18個(gè)NTLs蛋白、水稻的5個(gè)NTLs蛋白、谷子的8個(gè)NTLs蛋白同玉米的7個(gè)NTL蛋白進(jìn)行了進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果表明上述38個(gè)膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子被分成5個(gè)亞組，ZmNTLs分布于其中的I-IV4個(gè)亞組中，ZmNTL2/ZmNTL3和AtNTL4位于第I組內(nèi)，ZmNTL4和AtNTL7位于第II組內(nèi)，ZmNTL1/ZmNTL5、AtNTL8和AtNT

5、L5位于第III組內(nèi)，ZmNTL6/ZmNTL7和AtNTL6和AtNTL9位于第IV組內(nèi)，預(yù)測在一個(gè)亞組中的成員可能有相似功能。通過MEME進(jìn)行的保守motif分析表明，玉米NTLs的保守motif比擬南芥多。ZmNTLs與AtNACs、OsNACs的進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，ZmNTLs與擬南芥中的某些NAC轉(zhuǎn)錄因子具有較近的進(jìn)化關(guān)系，例如ZmNTL1與ANAC086、ANAC045，ZmNTL2與VND6、VND7等，這預(yù)示著ZmNTLs

6、可能與某些擬南芥的NAC有相似的功能。
　　（3）ZmNTLs亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性分析
　　以玉米B73自交系為材料，克隆了7個(gè)ZmNTLs基因的CDS，構(gòu)建了它們的GFP瞬時(shí)表達(dá)載體，將它們轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)ZmNTL1-5和7定位于細(xì)胞質(zhì)膜上；ZmNTL6定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。酵母轉(zhuǎn)錄激活活性分析發(fā)現(xiàn)，所有的ZmNTLs均有轉(zhuǎn)錄激活活性。β-半乳糖苷酶報(bào)告基因定量檢測表明ZmNTL2轉(zhuǎn)錄激活活性最高，其次是Zm

7、NTL6；ZmNTL4與ZmNTL7相對(duì)較弱。
　?。?）ZmNTLs的時(shí)空表達(dá)模式
　　Real-time PCR分析表明，ZmNTL1-7表達(dá)具有明顯的組織特異性。ZmNTL1，-2在根、莖、葉中均有表達(dá)，其中ZmNTL1在葉中表達(dá)量最高，ZmNTL2在莖中表達(dá)量最高，ZmNTL3-7主要在莖中表達(dá)。
　?。?）ZmNTLs對(duì)非生物脅迫及激素的響應(yīng)模式
　　對(duì)三葉期玉米幼苗進(jìn)行了非生物脅迫（干旱、高鹽、低溫、

8、H2O2）及激素（ABA、BR、GA、2,4-D、MeJA、KT）處理下的Real-time PCR分析，結(jié)果表明ZmNTL1-7對(duì)非生物脅迫及激素響應(yīng)的表達(dá)模式表現(xiàn)出多樣性特征。在ABA、H2O2脅迫下，ZmNTL1-7在根和莖中均顯著上調(diào)，表達(dá)模式相近；而在PEG處理下，ZmNTL1-7在莖中表達(dá)顯著下調(diào)；ZmNTL1-7均受ABA、MeJA、BR、2,4-D、KT誘導(dǎo)為上調(diào)表達(dá)；尤其對(duì)ABA和MeJA響應(yīng)最為強(qiáng)烈；GA處理下表達(dá)最

9、弱，ZmNTL1，-4，-6有少量誘導(dǎo)，ZmNTL7被抑制，ZmNTL2，-3，-5沒有明顯變化。
　?。?）玉米ZmNTL1、ZmNTL2、ZmNTL5擬南芥過表達(dá)系的獲得
　　將ZmNTL1、ZmNTL2、ZmNTL5全長及其去除跨膜結(jié)構(gòu)域（△TM）的片段連接到過表達(dá)載體pK2GW7中，分別獲得了它們的轉(zhuǎn)基因擬南芥純系種子。發(fā)現(xiàn)與在正常生長條件下，它們的主根長度及苗生長勢與野生型無差異。
　　（7）ZmNTL擬南芥

10、過表達(dá)系對(duì)過氧化氫脅迫的響應(yīng)
　　ZmNTL1、-2、-5去除跨膜結(jié)構(gòu)域（△TM）的轉(zhuǎn)基因擬南芥過表達(dá)系野生型（Col-0）的種子分別點(diǎn)在1/2MS固體培養(yǎng)基上，根長到1cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)移到含有0.5mM、1mM、1.5mM和2mM H2O2的培養(yǎng)基上進(jìn)行脅迫處理，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因系能夠明顯緩解了過氧化氫的抑制作用，這三個(gè)ZmNTLs基因都響應(yīng)過氧化氫脅迫。
　?。?）ZmNTL1在水淹脅迫中的作用研究
　　在土壤水分飽和

11、的狀態(tài)下，35S::ZmNTL1轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀態(tài)與對(duì)照無明顯差異，35S::ZmNTL1-△TM生長狀態(tài)明顯弱于對(duì)照，表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、植株矮化、葉片卷曲，表明ZmNTL1降低了擬南芥對(duì)水淹脅迫的耐受性。Real-time PCR分析表明，在水淹下，35S::ZmNTL1-△TM中的AtRrbohD表達(dá)明顯低于對(duì)照，AtICL、NADP-ME1、AtADH1表達(dá)顯著高于對(duì)照。EMAS（凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)）分析發(fā)現(xiàn)，ZmNTL1-△TM蛋白能

12、夠與AtRbohD啟動(dòng)子的4個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，表明ZmNTL1直接調(diào)控AtRbohD的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在水淹下，擬南芥rbohd（敲除系）生長受到抑制，而35S::AtRrbohD生長優(yōu)于對(duì)照，表明AtRrbohD參與了擬南芥對(duì)水淹脅迫的調(diào)控。將AtRbohD的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入35S::ZmNTL1-△TM中，35S::ZmNTL1-△TM對(duì)水淹的敏感性得到恢復(fù)，從遺傳上證明了ZmNTL1和AtRbohD的直接調(diào)控關(guān)系。綜上，ZmNTL1作為一個(gè)水淹

13、脅迫的負(fù)調(diào)控因子，可通過直接下調(diào)AtRbohD表達(dá)來降低對(duì)水淹的耐受性。
　?。?）ZmNTL2在調(diào)控植物木質(zhì)素合成中的作用研究
　　35S::ZmNTL2和35S::ZmNTL1-△TM轉(zhuǎn)基因擬南芥生長7周時(shí)，莖的硬度明顯優(yōu)于野生型。甲苯胺藍(lán)和間苯三酚染色發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，過表達(dá)系植株莖木質(zhì)部中被染色的細(xì)胞數(shù)明顯增多，且著色深，表明木質(zhì)素分布范圍和含量均高于對(duì)照。原位雜交結(jié)果表明，ZmNTL2主要在木質(zhì)部表達(dá)。Real-