1、肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率目前有上升趨勢，在亞洲，有數(shù)量非常龐大的患者正在遭受肝細(xì)胞肝癌（HCC）、尤其是乙肝和丙肝病毒感染相關(guān)HCC的痛苦。HCC侵襲性極強(qiáng)，預(yù)后差，因此，早期診斷、早期治療對肝癌尤其重要。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是臨床上診斷HCC最常用的腫瘤標(biāo)志物之一，但敏感性較低（70％左右），特異性也較低（64％），單獨(dú)應(yīng)用A

2、FP診斷HCC容易造成漏診和誤診。因此，從血漿/血清中尋找新的HCC早期診斷指標(biāo)物是HCC相關(guān)研究的一大熱點(diǎn)。 本文在已有工作的基礎(chǔ)上，以5例肝細(xì)胞肝癌（HCC）患者血漿為研究對象，選用免疫親和色譜去除血漿中六種主要高豐度蛋白、離線反相液相色譜法預(yù)分級血漿低豐度蛋白并收集差異表達(dá)蛋白組；通過二維納流液相色譜芯片富集、分離酶解肽混合物，線性離子阱質(zhì)譜途徑在線鑒定差異蛋白，為從血漿中篩選診斷HCC的新穎標(biāo)志物提供了可行的技術(shù)路線。

3、 一、樣本收集與處理 為了研究工作具有可比性，按照HUPO（Human Proteome Organization）推薦的選取健康志愿者標(biāo)準(zhǔn)與收集處理標(biāo)準(zhǔn)選擇和處理正常對照組和肝細(xì)胞肝癌患者組血漿標(biāo)本。 二、血漿中高豐度蛋白的去除 血漿蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的首要瓶頸問題之一是血漿高豐度蛋白的去除。研究工作選用曾在HUPO PPP（Plasma Proteome Project）項(xiàng)目中廣泛使用的多重親和去除系統(tǒng)[M

4、ARS（Agilent Mutiple Affinity RemoveSystem）Spin Cartridge]去除血漿中六種主要高豐度蛋白（白蛋白、結(jié)合珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗胰蛋白酶），并用Amicon Ultra-4（3 kDa）濃縮得到血漿低豐度蛋白質(zhì)組。 在去除HCC血漿中高豐度蛋白質(zhì)組前，用一維聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）驗(yàn)證了MARS Spin Cartridge去除正常

5、對照血漿高豐度蛋白的效果。 對健康志愿者混合血漿和5例HCC患者血漿中MARS柱結(jié)合的高豐度蛋白和流出的低豐度蛋白Bradford法定量結(jié)果表明該方法可有效去除血漿高豐度蛋白，去除率為85％，重復(fù)性好。 三、血漿低豐度蛋白質(zhì)組預(yù)分級 考慮到疏水性蛋白質(zhì)在生物標(biāo)志物中的重要性，研究工作采用反相高效液相色譜（Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography，R

6、P-HPLC）對血漿低豐度蛋白質(zhì)組進(jìn)行預(yù)分級，包括：①以正常對照血漿低豐度蛋白組為樣本考察并優(yōu)化樣本的前處理、反相色譜條件和手動(dòng)收集色譜峰延遲時(shí)間；②按照優(yōu)化的分離條件對正常對照血漿、HCC患者血漿低豐度蛋白組進(jìn)行預(yù)分級，收集HCC血漿樣本差異表達(dá)色譜峰。 研究工作表明，與健康志愿者混合血漿低豐度蛋白質(zhì)組的分級結(jié)果比較，HCC患者血漿低豐度蛋白質(zhì)組中出現(xiàn)了共同高表達(dá)的色譜差異峰B，共同低表達(dá)差異峰C；1＃HCC患者血漿低豐度蛋白

7、質(zhì)組中出現(xiàn)了特有高表達(dá)色譜峰A。 四、二維納流液相色譜芯片/離子阱質(zhì)譜分析 分別對研究中選擇的1號HCC患者血漿低豐度蛋白質(zhì)組中共同高表達(dá)色譜差異峰B、特有高表達(dá)色譜峰A進(jìn)行了進(jìn)一步的二維液相色譜-芯片離子阱質(zhì)譜分離與分析。 差異表達(dá)蛋白組經(jīng)離線胰酶酶解后，采用二維液相色譜-芯片（HPLC-Chip，包含一支納升級Zorbax300SB-C18富集柱和一支納升級Zorbax300SB-C18分析柱）富集、分離肽混

8、合物，線性離子阱質(zhì)譜在線分析，以Spectrum Mill MS Proteomics Workbench自動(dòng)分析MS和MS/MS數(shù)據(jù)后在UniProtKB/SWISS-PORT數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，鑒定得到27種差異蛋白，其中23種蛋白與各種疾病或腫瘤相關(guān)，IMP3（Insulin-like growth factor2 mRNA-binding protein3）、ARNT2（Aryl hydrocarbon receptor nucl